ELISA實(shí)驗樣本處理方法

    常規用于ELISA實(shí)驗的樣本包含血清、血漿、細胞培養上清、尿液以及組織勻漿等。不同樣本類(lèi)型的預處理方法存在差異，合適的樣本預處理是確保ELISA實(shí)驗正確性和準確性的first步。這里，我們將介紹幾種不同樣本類(lèi)型的處理方法。

    一、血清
    血清是ELISA實(shí)驗常用的樣本，其預處理也十分簡(jiǎn)單。

    使用無(wú)熱原無(wú)內毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來(lái)）。2-8℃下以1000×g離心20分鐘，小心收集上清液（血清），立即進(jìn)行測定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復凍融。

    在收集血液樣本的過(guò)程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時(shí)會(huì )釋放具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實(shí)驗中將會(huì )出現非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確。另外，樣本還應避免細菌污染，因為細菌可能含有內源性HRP，也會(huì )導致檢測結果不準確。

    二、血漿
    使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內，2-8℃下以1000×g離心15分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復凍融。樣本應避免溶血或高血脂。常見(jiàn)的抗凝劑包括EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細閱讀ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。

    三、細胞培養上清
    將細胞培養上清液吸入離心管中，在2-8℃下以1000×g離心20分鐘，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復凍融。

    四、細胞提取液
    反復凍融方法
    1.吸出培養板中的培養基，用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量的培養基將培養板上的細胞沖洗干凈。懸浮細胞可以省略該步驟。
    2.將細胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃下以1000×g離心5分鐘，然后吸去培養基，用預冷PBS洗滌細胞3次。
    3.加入適量的預冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。在6孔培養板（約1×106個(gè)細胞）中，每個(gè)孔加入150-250μL的PBS來(lái)重懸細胞。
    4.使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復凍融，重復凍融過(guò)程數次，直至細胞*裂解。也可以使用超聲波細胞破碎器超聲處理懸浮液來(lái)裂解細胞。
    5.2-8℃下以1500×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。

    五、組織勻漿
    1.用預冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)（勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果）。
    2.將組織塊稱(chēng)重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
    3.加入適量的預冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進(jìn)一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復凍融。
    4.將勻漿液吸入離心管中，2-8℃下以5000×g離心5分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反復凍融。

    六、唾液
    在2-8℃下，4000×g離心10分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測。建議使用新鮮的唾液樣本檢測。

    七、尿液
    使用無(wú)菌容器收集尿液樣本。在2-8℃下，1000×g離心15分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測。

    八、糞便
    將糞便樣本用PBS(0.01M, pH=7.4)重懸,置于冰上振蕩15分鐘,然后在2-8℃，5000×g離心5分鐘，取上清即可檢測。

    九、其他生物體液
    請咨詢(xún)技術(shù)支持。

    樣品注意事項
    1.樣品收集后若在1周內進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個(gè)月內檢測)，或-80℃(3個(gè)月內檢測)，避免反復凍融。融化樣本在試驗前請再次離心以去除凍融后可能出現的沉淀物。

    2.試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品Max值，請根據實(shí)際情況，做適當倍數稀釋(建議查閱文獻后先做預實(shí)驗，以確定稀釋倍數)。

    3.若所檢樣本不在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中，建議做預實(shí)驗驗證其檢測有效性。

    4.若使用化學(xué)裂解液制備組織勻漿或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會(huì )導致ELISA測值出現偏差。樣本中不能含有會(huì )抑制HRP活性的NaN3，否則會(huì )造成假陰性結果。